CHEF gel

From Crop Genomics Lab.
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CHEF gel protocol

사용전 유의사항

증류수로 3~4시간 정도 약 3차례 washing 과정이 필요함

3차 증류수를 이용하는 것이 좋으며, washing 후에는 D.W를 뺀 후에 자연건조 시킨다. 이 때는 전기를 걸어주거나 cooler를 작동시킬 필요는 없다


1 Gel 만들기 : 0.5X TBE buffer or 0.5X TAE buffer를 이용하여 1% agarose gel(w/o EtBr or safeview)를 만든다. (큰 것 200ml, 작은 것 150ml)


2 Gel을 만든 후, CHEF 기계에 약 2L 의 0.5X TBE buffer or 1X TAE buffer를 넣고 기계의 전원을 모두 켠 다음, Cooling module과 PUMP를 이용하여 buffer의 온도가 14도가 되도록 cooling을 미리 시켜둔다. 30도 정도 지나면 14도로 떨어진다.

  • 작동 순서 : Power - pump 전원 - cooler 전원 - run
  • Pump가 제대로 작동하지 않는 상태에서 cooler를 작동시킬 경우 기기 내 모세관이 얼어 막히므로 확인 후 작동 시킬 것


3 Gel이 다 굳으면, Gel만 조심히 들어내어 CHEF기계의 gel을 놓는 자리에 조심히 자리시킨다.(작은 gel 조각이 있을 경우 PUMP를 막을 수 있으므로, 잘 확인할 것)


4 PUMP 기계를 정지 시킨 후, DNA를 loading하고(1ul 정도 loading), marker를 1mm정도 잘라서 marker well에 집어 넣는다. (marker : Lambda Ladder PFG Marker, 일반 DNA ladder도 가능)


5 PUMP 기계를 켜서 Variable speed를 60-70 정도의 수치로 맞추면서 gel이 움직이지 않는 지 확인한다.


6 Power module의 START/Pause 버튼을 눌러서 22시간동안 running한다.

  • 보통 current는 100~200mA가 정상이며, 300 이상의 전류가 걸리면 washing 과정이 더 필요하며, 500 이상 넘어가게 되면 기기가 자동으로 멈추게 됨
  • TAE buffer 사용시에는 1X로 사용해야 하며, TBE 보다는 current가 높아짐
  • 중간에 멈추고 싶을 경우 START/Pause 버튼을 길게 누를 것
  • Cooler의 경우 한번 멈추면 약 30분 후에 다시 전원을 켜야 함
  • nld 라고 경고 메세지가 뜨는 경우는, 전류가 잘 통하지 않는 경우. 탱크 뚜껑을 잘 닫거나, 버퍼 농도를 잘 맞춰서 해결


7 다음날, running이 끝난 것을 확인 한 후, gel을 조심히 꺼내어 EtBr 혹은 Safeview staining을 진행한다 : 약 30분 정도 용액에 담가둠


8 CHEF 기계의 Electrophoresis chamber의 Buffer를 Draining 시키고 TDW를 이용하여 washing 후 자연건조 시킨다.


<TBE와 TAE의 차이>

TBE가 TAE 보다 buffering capacity가 높고 더 높은 resolution을 보여준다.

DNA sequencing과 같이 acrylamide gel을 이용하고 오랜 시간 동안 electrophoresis를 해야하는 경우, Buffering capacity가 좋고, high voltage에서 열이 덜 나는 장점을 갖는 TBE가 유리하다.

오랜 시간동안 TAE buffer를 이용하여 running을 하는 경우, 온도가 증가하게 되고, Tris의 온도 dependancy에 따라서 pH가 약간 감소할 수 있다.

Acetate의 경우 large DNA fragment의 seperation을 도와준다.

CHEF system에서 1kb에서 2Mb의 DNA는 TBE buffer가 적당하고, 2MB 이상의 DNA에서는 TAE buffer가 적당하다.

반대로 TAE의 장점은 50X로 stock solution을 만들어서 오랫동안 보관이 가능하고, DNA를 gel로 부터 isolation하여 ligation하는 경우 유용하다.

Borate는 Enzyme inhibitor로써 작용하여 후에 enzymatic step이 필요한 DNA purification을 하는 경우에는 좋지 않다.


<실험 조건>

Initial time : 50sec

Final time : 90sec

Run time : 22hr

Voltage : 6V

Angle : 120